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流体静压对色氨酸合成酶平衡构象的影响

发布时间:2017-10-20

流体静压色氨酸合成酶平衡构象的影响

罗伯特 菲利普斯

生物化学分子生物学系

乔治亚大学

希腊雅典30602

简介

细菌色氨酸(TRP聚合酶是一个α2β2的四聚体,他是一个β二聚体两端各连接一个α-亚基,α亚基β亚基通过复杂的协同变构低活性的构想开放,高活性的构想关闭,逐步达到一个稳定的状态。影响TRP合成酶构象的因素很多,包括α亚基配体、一价阳离子、溶剂、ph和温度。然而,静水压力对色氨酸合成酶构象的影响此前没有相关报道

我们现在发现静水压力对构象有很大的影响。在稳定的色氨酸合酶的平衡体现中,测定磷酸吡哆丝氨酸复杂的吸收光谱变化,完美发现静水压力可以使色氨酸合成酶变成稳定的低活性构象,而不是封闭的高活性构象。


样品的制备

用大肠杆菌细胞制备鼠伤寒沙门氏菌色氨酸合成酶α2β2复合体含聚酯,与trpA鼠伤寒沙门氏菌trpB基因。该酶稀释至终浓度为21.6µMαβ二聚体),在0.05米三乙醇胺盐酸盐缓冲液,pH8,要么0.1 M NaClNH4Cl0.1 m L-丝氨酸,记录相关数据

设备

OLIS公司的改良的14卡的紫外-可见分光光度计测量了静水压力对吸收光谱的影响。美国ISS公司HPcell高压样品仓,压力调控范围0-4 kbar0-400MPa高压电池配备了手动压力泵。外循环水浴保持样品仓温度在25°C含有用9毫米高的石英瓶装1毫升酶溶液。覆盖着聚四氟乙烯管和浸渍在光谱级乙醇作为加压流体。缓冲液,三乙醇胺盐酸盐,pH8,选择缓冲。压力不会显著改变,单位用pKapH值为1 bar,每次递增后扫描,压力增大

1.色氨酸合酶的丝氨酸在0.1 M NaCl溶液中的吸收光谱压力从1增加到1500bar1巴的TA空白缓冲用来获得基线读数。在压力范围内的光谱测量总时间约为一小时。由奥利斯公司的国际分析程序从对光谱进行了分析。

结果

1显示了增加静水压力从1巴到1500巴的效果。

色氨酸合酶与0.1 M NaCl的存在下,测定L-丝氨酸的复合物的吸收光谱。可以看出,423nm的吸收峰非常突出即为相应的开放的低活性构象。压力从1增加到1500 bar

376467 nm有两个等色点,表明存在两种平衡方式。图1中的350550纳米的光谱变化。

释放压力构象的可逆分析

350 nm以下的吸光度的缓慢增加是不可逆的,可能是由于通过丙酮酸缓慢形成实验中消除βL-丝氨酸在每一个压力下的平衡常数Kp施加的压力的对数成比例(图1,插图)。图1中的光谱数据通过对方程12的全局分析进行了拟合,其中Kp是平衡常数在压力PK0杆的平衡常数,∆V0体积对反应的改变,A00 bar的吸光度,AP是压强p的吸光度,和一个常数。是无限压力下的吸光度。K0为丝氨酸醛亚胺的形成0.12±0.0125°C,与0.11Keq值非常吻合25°C计算热分析得到的热力学参数。Global分析也提供了∆V0的反应,126±2毫升/摩尔计算光谱分析的组件以图1中的虚线显示。增加静水压力对色氨酸合成酶L-丝氨酸0.1米氯化铵溶液的复杂光谱的的影响是相似的;然而,在1-2kbar较高的压力下,我们需要看到一个显着的变化(未显示的数据)。K0∆V0NH4Cl的值,由拟合得到数据,是(2.34±0.08×10-4171±2毫升/摩尔: