站内搜索

服务热线

010-82782023

拉曼光谱在生物领域的应用

发布时间:2017-06-09

拉曼光谱在生命科学领域的应用

拉曼光谱作为一种无损、非接触的快速检测技术,已吸引广大科研人员的关注,并被应用于各行各业中。特别是在生命科学领域,由于拉曼样品用量很少,不需要对生物样品进行固定、脱水、包埋、切片、染色、标记等繁琐的前处理程序,不仅操作简单,而且不会损伤样品从而能够获得样品最真实的信息。另外,生物大分子多是处在水溶液环境中,研究它们在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系非常重要。由于水的红外吸收很强,因此用红外光谱研究生物体系有很大局限性,而水的拉曼散射很弱,干扰小,而且单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息可在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化,可以对细胞、病毒等进行原位检测分析。

基于上述优势,拉曼光谱在生命科学领域有着大量的研究工作,诸如基础研究生物医学、药物、化妆品以及食品中都有着广泛的应用

  1. 基础研究

基础研究包括组织结构及成分鉴别(脂类、蛋白质、糖类、水、DNARNA等)、细胞的定位、鉴别及分类等。

生物大分子中,蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质,研究它们的结构、构象等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。拉曼是分子的指纹图谱,生物分子的指纹区主要出现在100-2000cm-11拉曼对分子所处的环境非常敏感,结构上的些微差异都能在拉曼谱图上体现出来,如图1[1]

       

1 左:甲状腺肿恶性肿瘤的拉曼谱图;右:不同肌红蛋白拉曼谱图



2 细菌的三维拉曼成像

细胞是生命最基本的组成,是一切生命现象的基础。共聚焦显微拉曼光谱的发展对原位活细胞研究有着重要意义对于小尺寸的样品,如尺寸仅仅为1~2μm的细菌,通过真共焦的良好共焦特性,依然可以对其进行详细研究。如图2即是对细菌做的三维拉曼成像,可以清晰地分开微小的细菌(感谢英国CEH OxfordWei Huang博士提供数据)


另外,细胞种类繁多,如细菌有不同的菌种。通常,采用一些多元统计学方法,如聚类分析、主成分分析、判别分析等可以更好对研究对象进行评价。3是对3种不同的细菌在不同生长时间下获得的拉曼结果进行统计分析,结果显示对于同一细菌,尽管生长时间不一样,但是它们被归属于同一类,证明拉曼可以很好地鉴别不同种类的细胞。


3 多元分析对三种不同菌种的分类,其中abc分别代表三种不同细菌的训练数据,而粗体的abc代表测试数据(感谢英国CEH OxfordWei Huang博士提供数据


  1. 生物医学

             拉曼光谱在生物组织与疾病中的研究非常广泛,涵盖了几乎所有的软组织和硬组织,如脑组织、肺组织、肝组织、骨组织等。在很多空腔组织如肺、胃、结肠等中,可以将光纤包埋在内窥镜中实现拉曼光谱的活体实时检测。

             拉曼光谱可以从分子水平提供信息,这对于很多疾病的研究有着重要的意义。不同病变会在拉曼谱图中有不同的特征显示,通过拉曼光谱能够对不同疾病进行判断,如图4中甲状腺肿、腺瘤和甲状腺癌的拉曼光谱之间就有着很大的差异。

4 不同的甲状腺病变的拉曼光谱

此外,当疾病还处于早期阶段,组织结构上未见病变时,通过拉曼光谱的研究可以得到一些早期的病变信息。传统的癌症检测手段是病理标本染色,但是这种方法只能检测出与健康组织有明显区别的病变组织,当疾病还处于隐形阶段时则很难检测出来,这也是为什么发现癌症一般都是晚期的原因。拉曼可以获得细微的化学结构信息,即使是早期肿瘤,由于其DNA含量会急剧增加,拉曼可以捕捉到这些变化。如图5中早期肿瘤(绿色)和晚期肿瘤(红色)的DNA拉曼峰强要明显高于健康组织(胼胝体,皮质和血液)。拉曼成像图中红色区域晚期肿瘤与染色法诊断出的病理学吻合,而绿色区域拉曼谱图与红色区域的谱图一致,说明已经发生病变,然而染色法却没有将其检测出来。


5 肿瘤细胞早期诊断

左上:未染色鼠脑组织显微图像;

左下:伪彩拉曼成像图;

右:不同组织拉曼谱图,包括健康组织(胼胝体,皮质和血液)以及病变组织(早、晚期肿瘤)

(感谢法国兰斯大学Manfait教授及其同事提供的数据)


  1. 药物

             在药物配方中,通常除了有效成分之外,还包含很多辅料。而原料和辅料的分布对药物的溶解、吸收等一系列效应有着重要影响。根据拉曼光谱中不同成分信息的提取可以得到药片成分分布的图像,6。通过一些新的成像技术,如SWIFTTM高速共焦光谱成像配合DuoScan的应用,可以在短时间内对整个药片进行成像分析

6 药片不同成分的拉曼成像,单点采集时间为1ms48081341×141数据点成像时间535s其中红色、绿色和蓝色分别代表阿司匹林、咖啡因和扑热息痛

显微拉曼可以获得药片表面成分分布信息,而透射拉曼则能获得整个药片的平均信息,可以整个药片进行准确的定性、定量分析,从而能够测定不同批次或不同厂家药物含量的均匀度、进行真假药鉴定过程监控排错等。图7使用透射拉曼结合化学计量学方法对药片进行的定性、定量分析。其中左图样品是含2不同晶型药物的胶囊,每种胶囊6样品结果显示主成分分析法能有效区分开胶囊中晶型的差别;右图样品28含有不同主成分含量的药片7种含量,每种含量各4个样品使用偏最小二乘法对其进行定量分析发现结果具有非常好的线性。

7 透射拉曼分析结果。左图:主成分定性分析结果;右图:偏最小二乘法定量分析结果

由于拉曼光谱是无损的检测方法,它还可以用于药物与细胞之间相互作用的研究。如药物与细胞作用的位点、在细胞中的分布、药物在细胞内的动力学研究等等。因此,拉曼光谱也在药物的筛选等工作中有着广泛应用。8是药物作用于细胞后的拉曼成像结果,其中绿色是纯药物的分布位置,紫色、蓝色和粉色分别是药物作用于细胞膜、细胞质和DNA形成复合物后的成分分布图。最后一张是所有成分分布的叠加。











药物

细胞膜和细胞器

极性细胞质

药物-DNA

复合物

各成分叠加图


8 药物与细胞的相互作用分布图,前4张图从左到右分别是纯药物、药物与细胞膜、与细胞质、与DNA形成复合物的分布图,第5张是前4张图的叠加。

  1. 化妆品

             大部分化妆品是直接和人体接触的,它们的安全性以及效果备受人们关注,无损的实时检测更是对此行业有着重要意义。

由于拉曼光谱无侵入无损伤,可直接对志愿者的皮肤进行检测研究,能够实时的监测产品效果。通过共聚焦拉曼光谱仪可以对皮肤含水量进行深度分析,如图9所示,在不同深度处皮肤的含水量不同,并且在涂抹保湿霜后在不同深度有不同的变化。由此可以判断保湿霜的效果。染发护发产品的穿透效果深受各大品牌关注。将拉曼光谱应用于产品作用于头发的效果研究,可以通过产品的特征谱带追踪产品的穿透深度,从而对产品的效果进行判断。

9  A 皮肤不同深度的水的拉曼光谱;B产品在头发中的穿透深度。(感谢欧莱雅提供的数据)

外,很多化妆品都是乳液,其乳滴的稳定性、有效成分在乳滴中分布的均匀性等都是影响化妆品质量的重要因素。拉曼成像可以获得化妆品乳液中颗粒或相态分布、乳滴中的成分分布等信息,如图10,从而在化妆品的研发和质量控制中有着重要的作用

10 化妆品乳液拉曼成像(感谢联合利华提供的数据)

  1. 食品

             苏丹红、三聚氰胺、瘦肉精等一系列事件迫使人们越来越关注食品安全这个与健康密切联系的议题。拉曼光谱作为一种无需样品前处理、灵敏度相对较高、分析测试快速便捷的绿色光谱技术,对于食品质量检测[2]食品细菌鉴别[3]及食品加工[4]等都有重要应用。

1#

2#

11 不同饱和度脂肪酸甘油酯的主成分分析结果


很多同类食品的结构非常相似,如食用油都是脂肪酸,但是动物食用油主要是饱和脂肪酸而植物油主要是不饱和脂肪酸。对于这些结构相似的化合物,使用化学计量学方法可以有效地将它们区分开,如图11中的硬脂酸甘油酯1#样品含不饱和脂肪酸甘油酯,而2#样品是饱和脂肪酸甘油酯,两种样品各取6个点,经主成分分析法归类后发现,拉曼可以区分开这两种非常相近的样品。

2007年美国发生多起猫、狗宠物中毒死亡事件,经拉曼研究分析发现猫粮中三聚氰胺三聚氰酸可以在肾组织中形成复合物晶体,阻塞肾小管内腔,量多严重者可致死。图12是猫服用三聚氰胺、三聚氰酸添加猫粮后在肾中形成复合物晶体的拉曼分析结果[5]A是猫肾显微图像B是肾中形成的结晶,其中黑色框是拉曼成像位置,C是成像区域的拉曼图,D是伪彩色显示的拉曼强度分布图,EF是体外模拟实验得到的复合物拉曼谱图和显微图实验结果显示猫肾中形成的结晶与体外合成得到的结晶成分一致。

12 三聚氰胺、三聚氰酸在猫肾中形成的复合物拉曼分析结果。

             拉曼光谱可以用于食品产地、品质等各方面的判定与研究。以玉米为例,种子中的淀粉、蛋白质、脂类含量决定了玉米的品质通过拉曼光谱成像可以获得玉米中不同成分的分布图(图13

13 玉米种子切片的拉曼成像

小结

             拉曼光谱作为一种无损无标记的分析方法,它能够从分子层面对生命科学领域的样品提供丰富的信息。共聚焦技术、新的成像方法为此项技术在生物领域的应用提供了坚实的技术支持。近年来国内外研究者将拉曼光谱应用于细胞药物处理、细胞水平疾病诊断、单细胞生命活动监测、亚细胞结构等研究取得了不同程度的进展。随着研究的深入,拉曼光谱分析技术必将在于细胞癌症研究、细胞分选、药物筛选、食品安全生命科学领域大有作为。

参考文献:

[1] Filip Tintchev et al. Molecular effects of high-pressure processing on food studied by resonance Raman. Ann. N.Y. Acad. Sci, 2010, 1189, 34-42.

[2] Dorthe Kjær Pedersena et al. Early prediction of water-holding capacity in meat by multivariate vibrational spectroscopy. Meat Science 65, 2003, 581-592.

[3] Mario Krause et al., Identification of active fluorescence stained bacteria by Raman spectroscopy. Proc. of SPIE, 2008, 6991, 69910E.

[4] Filip Tintchev et al., Molecular effects of high-pressure processing on food studied by resonance Raman. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1189, 2010, 34–42.

[5] R. Reimschuessel, M. Witkowski et al., Evaluation of the renal effects of experimental feeding of melamine and cyanuric acid to fish and pigs. Am J. Vet Res., 69, 2008, 1217-1228.